안녕하세요 레보딕스입니다.
오늘 소개해드릴 제품은 MN사의 Column입니다.
컬럼을 고르실 때 순상, 역상 용어를 들어보신적이 있으실 겁니다.
오늘은 HPLC의 컬럼 분리 모드에 대해서 설명드리겠습니다.
먼저 MN사에 대해 소개해드리겠습니다.
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컬럼(HPLC column)
MN
HPLC 컬럼은 고정상이 충진되어있는 관 입니다.
그 고정상의 성질에 따라 순상
크로마토그래피(normal-phase chromatography)와
역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography) 로 나눌 수 있습니다.
순상 크로마토그래피의 컬럼은 고정상이 극정인 물질로 이루어져 있어서
이동상으로는 비극성인 핵산(hexane)같은 용매를 사용할 수 있습니다. 극성이 큰 물질이 나중에 용출 됩니다.
역상 크로마토그래피의 컬럼 안에는 비극성인 고정상 충진제가 들어있기때문에 극성인 이동상을 사용해야 합니다.
그렇기 때문에 이동상에 녹아 있는 극성의 높은 물질을 분리하는데 좋은 방법입니다.
여기서 잠깐 극성이 무엇인지 간단히 말하자면,
양쪽에서 줄다리기를 하고 있다고 생각할 때 한 쪽으로 더 끌려 갈 수록 극성이 높다(극성)고 하고
팽팽하게 양쪽이 당기는 힘이 같으면 극성이 낮다(비극성)고 말합니다.
이외에도 분자를 분리하는 방법에는 분자 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC),
이온 교환 크로마토그래피 (ion exchange chromatography)가 있습니다.
분자 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)는
미세한 체와 같은 작은 구슬들을 가득 채운 컬럼을 씁니다.
상대적으로 큰 물질은 저 구슬 속으로 들어갈 수 없기 때문에
이동 거리가 짧아져서 빨리 나오게 되고 상대적으로 작은 물질은 구슬 속을 들락날락할 수 있어
이동거리가 길어지므로 늦게 나오게 되는 것입니다.
구슬의 크기나 특성에 따라서 걸러낼 수 있는 크기가 정해지게 됩니다.
이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)는 정지상을 이온화시켜서
물질의 이온화 정도에 따라 상호 작용 차이가 나게 만듭니다.
생화학이나 분자생물학에서 단백질을 정제할 때 친화도 크로마토그래피와 더불어 매우 자주 보게 되죠.
서로 다른 단백질은 특정 pH에서 서로 다른 전하를 가지게 되기 때문입니다.
분리 모드의 선택이란 어떤 컬럼을 사용하느냐를 정하는 것과 같습니다.
보통 분리하고자 하는 물질에 따라 분리 모드를 선택 합니다.
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물질의 간단한 특성(수용성, 지용성)에서부터 물질의 형태에 따른
분리모드의 선택을 통해 HPLC컬럼을 선정하게 됩니다.
보통은 역상모드를 많이 사용하게 되는데요.
사용하는 용매가 보통 극성이기 때문에 물이나 메탄올, Acetonitrile같은
비교적 냄새가 적고 작업하기 편리한 이동상을 사용합니다.
역상 컬럼의 이점을 설명드리겠습니다.
우선 역상컬럼은 폭넓은 물질에 적용가능하기 때문에
다른 분리 모드에 비해 적용 범위가 넓습니다.
또한 높은 분리능을 가지고 있기 때문에 정밀한 분리를 필요로 하는 분석에 사용 가능합니다.
역상크로마토그래피는 다양한 작용기를 가지고 있어 물질별로 가장 적합한 컬럼을 선택할 수 있습니다.
이 중에서도 C18컬럼이 가장 많이 사용되는데요.
MN사 역시 다양한 종류의 컬럼을 보유하고 있습니다. 관능기(작용기)의 종류에 따라
탄소의 수가 늘어나면 소수성과 평면인식능력은 좋아지지만
수소결합성은 떨어집니다.
내가 분석하고자 하는 물질들이 어떤 영역에 속하는 지 확인하고
컬럼을 선택하여야 쉽게 물질 분리를 진행할 수 있습니다.
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HPLC컬럼 안에서는 무슨 일이 일어나고 있는 것일까요?
샘플의 종류와 상태에 따라 또는 분리하고자 하는 활용도에 따라 각 모드 선택해서 분석을 진행합니다.
HPLC컬럼의 충전제는 보통 구멍이 뚫려있는 다공성 구조로 되어 있습니다.
그 이유는 분리하고자 하는 물질과 상호작용을 할 수 있는 표면적을 극대화하기 위해서입니다.
물질이 컬럼내부에 들어가면 각 물질별로 상호작용의 크기가 다르기 때문에
컬럼끝까지 밀려나는 속도도 차이가 납니다.
그 속도를 머무름 시간 (Retention time)이라고하고 그 차이에 따라 물질을 분리하고 분석할 수 있게 됩니다.
용질(분리대상)이 고정상과 보다 강한 상호작용 -> 오래 유지
용질(분리대상)이 이동상과 강한 상호작용 -> 짧게 유지
머무믐 시간은 동일 조건에서 같은 물질은 동일하게 나오기 때문에 이런 현상을 이용하여 분석과 분리를 할 수 있게 되는 것입니다.
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